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以前，相關(guān)研究依靠低通量的微生物群培養(yǎng)手段。但隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，能夠使我們以較高通量的方法去了解腸道微生物種。近年來，三代測序技術(shù)發(fā)展迅速，又彌補(bǔ)了二代測序技術(shù)的一些不足，兩者相結(jié)合，為探索腸道微生物種提供了較好的方法條件。

王軍 中國科學(xué)院微生物研究所研究員

近10年來，腸道微生物基因組成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。然而，目前大部分相關(guān)研究，仍使用主流二代測序技術(shù)進(jìn)行腸道微生物種功能解析，宏基因組的拼接質(zhì)量仍然有較大提高空間，且菌株水平的功能差異分析等領(lǐng)域亟待新的突破。

不久前，我國首部生物經(jīng)濟(jì)的五年規(guī)劃《“十四五”生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展規(guī)劃》發(fā)布。該規(guī)劃明確指出，加快發(fā)展高通量基因測序技術(shù)，推動(dòng)以單分子測序?yàn)闃?biāo)志的新一代測序技術(shù)創(chuàng)新。而近期，三代測序技術(shù)已引發(fā)整個(gè)行業(yè)的關(guān)注，不少企業(yè)正積極布局，將其作為二代測序技術(shù)的有效補(bǔ)充，在針對二代測序范圍外的復(fù)雜基因突變類型進(jìn)行測序方面尋求新的解決方案。

有鑒于此，中國科學(xué)院微生物研究所王軍研究員課題組和中國科學(xué)院動(dòng)物研究所宋默識研究員課題組合作，利用三代納米孔測序技術(shù)解析了腸道宏基因組，建立了三代和二代測序數(shù)據(jù)混合組裝和后續(xù)分析流程。該研究提高了宏基因組組裝的質(zhì)量，以及對結(jié)構(gòu)變異的發(fā)現(xiàn)能力，發(fā)現(xiàn)了大量包括插入突變和基因倒位在內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異對于菌株水平上基因功能的影響，并對噬菌體等系統(tǒng)進(jìn)行了深度挖掘，這些都是將三代納米孔測序技術(shù)用于腸道微生物研究后取得的新進(jìn)展。該研究論文近日發(fā)表在《自然·通訊》雜志上。

兩代測序技術(shù)聯(lián)手探索腸道微生物

人類的腸道是細(xì)菌、真菌等微生物的家園，這些微生物被統(tǒng)稱為腸道微生物群。科學(xué)家們現(xiàn)在已經(jīng)收集了人類腸道中4600多種細(xì)菌的20萬個(gè)基因組和1.7億個(gè)蛋白質(zhì)序列，并建立了數(shù)據(jù)庫。

盡管科學(xué)家長期致力于這一領(lǐng)域的研究，但腸道菌群中的一些微生物種類在很長時(shí)間內(nèi)不為人所知。據(jù)估計(jì)，人體內(nèi)含有的微生物數(shù)量比人體細(xì)胞還多。在人類腸道中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了共計(jì)4600余種細(xì)菌。有研究表明，這其中超過70%的被檢測到的細(xì)菌還未在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，它們在人體內(nèi)的活性仍然未知。

“在人的腸道中，尤其是在直腸里，有非常豐富的微生物，個(gè)體數(shù)量超過人體細(xì)胞的3—10倍。雖然這些微生物種的基因組較小，但由于種類很多，其基因多樣性比人高10—100倍。”王軍告訴記者，腸道微生物群落形成了一個(gè)非常復(fù)雜的腸道環(huán)境，對其進(jìn)行研究有助于了解腸道的狀態(tài)和功能，從而更好地了解人體和疾病，指導(dǎo)胃腸道疾病的診斷和治療。

宋默識表示，腸道微生物在人類代謝食物、抵御感染和應(yīng)答藥物等過程中起著非常重要的作用。腸道維持著人體的代謝平衡，很多食物會在腸道內(nèi)最終降解成小分子最終代謝物。如果腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)失衡，將導(dǎo)致代謝功能失調(diào)，造成胃腸道疾病。同時(shí)，一些腸道免疫性疾病（如炎癥性腸炎）也與腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。因此，腸道微生物群一直是科學(xué)家們最關(guān)注的議題之一。

但受研究方法的限制，相關(guān)研究一直進(jìn)展較慢。

“以前，相關(guān)研究依靠低通量的微生物群培養(yǎng)手段。但隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，能夠使我們以較高通量的方法去了解腸道微生物種。近年來，三代測序技術(shù)發(fā)展迅速，又彌補(bǔ)了二代測序技術(shù)的一些不足，兩者相結(jié)合，為探索腸道微生物種提供了較好的方法條件。”王軍說。

三代測序是二代測序的有益補(bǔ)充

王軍向記者介紹，以納米孔測序?yàn)榇淼娜鷾y序技術(shù)飛速發(fā)展，目前英國ONT測序和美國PacBio測序兩種技術(shù)路線，都能夠完成較長的DNA片段測序。

三代測序技術(shù)較二代測序技術(shù)有何不同？

對此，王軍表示，二代測序技術(shù)是目前的主流測序方式，已廣泛應(yīng)用于疾病和癌癥的研究，具有高通量的特點(diǎn)，但不足之處在于測出來的基因片段較短，對于復(fù)雜的基因組區(qū)域以及較大的結(jié)構(gòu)變異的檢測有一定的局限性。而三代測序技術(shù)則能夠幫助研究者針對感興趣的基因或區(qū)域進(jìn)行高深度測序研究。目前，三代測序技術(shù)已被應(yīng)用于疾病或癌癥領(lǐng)域人類基因遺傳標(biāo)志物、融合基因、甲基化檢測等研究中，方法主要有長片段PCR擴(kuò)增、CRISPR/Cas9靶向捕獲和液相探針捕獲三類。

在研究中，王軍課題組使用了二代測序與三代測序數(shù)據(jù)組裝拼接的辦法。“引入三代測序能夠彌補(bǔ)二代測序‘序列短’這一不足。三代測序讀出的長序列就像一個(gè)‘骨架’，能夠讓研究者知道二代測序讀出來的短片段之間有什么對應(yīng)關(guān)系，該怎樣拼接，從而提高整體基因拼接序列的質(zhì)量，提高對某個(gè)生物染色體的全面認(rèn)識。”王軍說。

在三代測序方法出現(xiàn)之前，研究者利用二代測序技術(shù)拼出大大小小的不同基因片段，但常常無法知道某些片段屬于哪個(gè)菌種。王軍表示，雖然存在一些計(jì)算方法使研究者可以依據(jù)峰段、頻率去推斷基因片段之間的關(guān)系，但由于缺乏直接證據(jù)，這一研究難題仍無法得到根本解決。

“三代測序技術(shù)改變了這一情況。將三代測序技術(shù)得出的數(shù)據(jù)與二代的進(jìn)行混合拼接，就能夠在很復(fù)雜的環(huán)境中幾乎接近拼出一個(gè)細(xì)菌的單個(gè)基因組。”王軍說。

三代測序技術(shù)未來還有更大發(fā)展空間

近年來，全球?qū)嶒?yàn)室都開始大規(guī)模應(yīng)用三代測序技術(shù)。

“每一個(gè)新測序技術(shù)剛出來的時(shí)候一般都很貴，大家都覺得是在‘燒錢’做研究。”王軍向記者介紹，盡管三代測序技術(shù)為精細(xì)探索基因功能提供了新的路徑，但其經(jīng)濟(jì)性仍不高，“三代測序技術(shù)的單位測序數(shù)據(jù)成本比二代要高很多。每次測序非常貴，一次出來的數(shù)據(jù)量約為二代的1/10，有時(shí)甚至還不到二代的3%。數(shù)據(jù)量少的特性是由三代測序技術(shù)的原理決定的。”

在充斥著電解液的容器中，放置鑲嵌有納米孔蛋白的分子膜。在相關(guān)蛋白質(zhì)和酶的輔助下，DNA分子以較為穩(wěn)定的速度通過納米孔，當(dāng)納米孔內(nèi)被特定的核苷酸占據(jù)時(shí)，會對孔周圍的電流產(chǎn)生擾動(dòng)。通過記錄DNA分子通過納米孔過程中產(chǎn)生的電流信號情況，再將這一特異性的電信號序列利用算法軟件翻譯為核苷酸序列，這就是三代測序技術(shù)的基本操作原理。

“目前的工藝決定了三代測序技術(shù)測出的數(shù)據(jù)量偏少。”王軍說，但其與二代測序技術(shù)相結(jié)合，能為建立更高質(zhì)量的基因圖譜作出貢獻(xiàn)。

下一步，三代測序技術(shù)還有哪些發(fā)展空間？

在王軍看來，開發(fā)序列信息解讀算法是一個(gè)發(fā)展方向。如何精確地將新一代基于納米孔的單分子實(shí)時(shí)電信號測序技術(shù)生成的原始電信號翻譯為序列信息，是科學(xué)家們關(guān)注的重點(diǎn)，近年來也誕生了多種用于精確翻譯電信號的相關(guān)工具。

同時(shí)，三代測序技術(shù)還能在甲基化檢測等特殊領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。三代測序技術(shù)能夠檢測DNA分子自身的物理化學(xué)特性，因此生物基因組上的修飾信息也可以在電信號中得到反應(yīng)。DNA分子上的甲基化修飾具有非常強(qiáng)的細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期特異性，對表觀遺傳學(xué)研究有著重要的意義。

“三代測序技術(shù)暫時(shí)取代不了二代測序技術(shù)，但在未來，它將成為測序技術(shù)不可缺少的組成部分，在甲基化檢測等獨(dú)特領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)其重要價(jià)值。”王軍說。